外泌體的分離
外泌體的樣本來(lái)源主要有細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿、尿液、腹水、乳汁、腦脊液、唾液、滑液等，其中細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿、尿液是最常見(jiàn)的來(lái)源。如果是使用細(xì)胞培養(yǎng)上清，要注意細(xì)胞培養(yǎng)中一定不能添加 FBS。
外泌體分離方法有很多種，包括超速離心、過(guò)濾離心、密度梯度離心、免疫磁珠和商用試劑盒。但是這么多方法中，我們通常推薦選用超速離心法進(jìn)行提取和分離，因?yàn)槌匐x心方法得到的外泌體不管是從得率還是純度上都比較好。其他方法的特點(diǎn)如下：
2過(guò)濾離心：得率比較低
2密度梯度離心：步驟繁瑣，得率較低
2免疫磁珠：特異性比較高，得率較低
2商用試劑盒：價(jià)格高，效果一般。分離出的外泌體電鏡和粒徑效果差。
超速離心法是目前價(jià)格適中、得率和純度都能兼得的一種方法。
外泌體的鑒定
外泌體分離之后，需要經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進(jìn)行鑒定。
2透射電鏡鑒定法：簡(jiǎn)稱(chēng)TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
2納米顆粒跟蹤分析法：簡(jiǎn)稱(chēng)NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度快，檢測(cè)后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
2Western blot分子標(biāo)志物檢測(cè)：外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細(xì)胞質(zhì)蛋白，如肌動(dòng)蛋白（Actin）和鈣磷脂結(jié)合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。
