SureSelect 人甲基化測序系統（Human Methyl-Seq）是首個全面的NGS靶向序列捕獲系統，將重亞硫酸鹽處理方法和Illumina高通量測序平臺相結合，進行全基因組甲基化捕獲測序，對DNA進行先捕獲后轉化的技術策略。可幫助研究人員關注那些已知甲基化可影響基因調控的區域：CpG islands、CpG island shores、CpG island shelves、 undermethylated 區域、啟動子、腫瘤及組織特異性甲基化區域 (DMR)、增強子、Ensemble 調控區域和DNase I 高敏感位點。
一、技術優勢與應用方向
技術優勢：
? 樣本類型：細胞、全血、新鮮冷凍組織，石蠟FFPE
? 重復性高：實驗重復性分析相關系數R2>0.97
? 高靈敏度：單堿基分辨率
? 可以檢測相對比較多的位點，370萬CpG位點
? 可進行甲基化單體型分析
應用方向：腫瘤方向研究、精神類疾病研究、復雜疾病研究、生長發育性研究、甲基化年齡研究等。
二、送樣建議
三、數據分析
甲基化捕獲測序原始數據以fastq（fq）文件格式存儲，對于下機的 FASTQ 數據需要進行質控，這里采用fastp和multiQC（版本：0.19.4），進行全方位質控，使用bismark（bismark版本: v0.19.0；bowtie2版本：2.3.4.2）進行甲基化基因組比對，使用qualimap/bedtools/samtools等工具對bam文件進行質量評估，統計測序數據的比對情況和靶標區域的捕獲效率，使用methylkit（版本：v1.6.1）工具可以直接讀取的基因組水平甲基化掃描文件，然后進行差異分析，研究內容包括差異甲基化位點DMS和差異甲基化區域DMR，并對甲基化區域DMR進行注釋以及富集分析。
生信分析流程
四、甲基化捕獲測序結果展示
1.甲基化捕獲測序數據QC結果
通過甲基化位點的甲基化值的密度曲線、樣本的非監督聚類圖和PCA圖等，整體的展示項目中所有樣本，在組間與組內的差異以及相互關系，不但能夠對樣本整體數據質量有一個直觀的了解，同時還可以考察數據結果與項目設計是否吻合。
數據QC圖：A. 甲基化位點的甲基化值密度曲線圖，將可以比較實驗組與對照組間整體的甲基化分布是否有差異，也可以考察是否有個別樣本的整體甲基化程度發生了改變。B. PCA圖，在二維或三維空間中以空間距離展示樣本間相互關系的遠近。對捕獲測序370w位點進行降維處理，以2~3個主成分差異代替370w個探針的差異。C. 樣本的非監督聚類聚類圖，數據接近的樣本，在關系樹中位于更近的位置。D. 樣本的相關性圖，樣本相關性熱圖用于展示樣本之間的相關性，相關系數越接近1，表明樣品之間甲基化模式的相似度越高。
2.甲基化捕獲測序差異甲基化位點結果
使用methylkit（版本：v1.6.1）工具，得到methylKit可以直接讀取的基因組水平甲基化掃描文件，對樣品進行分組進較，并得到的差異顯著位點（DMS），并對差異位點進行注釋。
差異甲基化位點圖：A. 熱圖，用于查看組間樣本的差異和組內樣本的相似程度，可明顯展示出組間樣本差異情況。B. 火山圖用于展示組間差異DMS的Δβ和顯著程度，圖中橫坐標為Δβ值，縱坐標為P值或adj.P值的負對數。圖中右上區域和左上區域分別代表hypermethylated和hypomethylated的點，且具有統計學差異的點。C、TSS上下游甲基化分布圖，提取甲基化位點相關信息，分析轉錄起始位點TSS上下游10kb的組間甲基化差異，展示樣本組間之間的整體差異。D. 差異位點基因組區域分布圖，不同區域發生甲基化其調控基因表達的方式有所區別，統計不同功能區域DMS 的數量。
3.甲基化捕獲測序差異甲基化區域結果
差異甲基化修飾區域（Differentially Methylated Region，DMR）指在基因組中差異甲基化位點經常會成簇出現，形成一段差異甲基化區域，其范圍小至數百bp，大到Mb級別。這些區域在基因表達調控方面發揮重要作用。DMR在基因組上的分布存在多樣性（啟動子、外顯子、內含子及基因間區等），因此它對基因表達調控的方式也是多樣的。
使用eDMR（版本：0.6.4.1）工具，結合所有甲基化位點的p值篩選最合適的DMR區間長度使得該區域上差異甲基化位點（DMS）的綜合p值達到顯著的水平，從而得到甲基化區域（DMR）。
利用DMR所在的基因組位置與基因組結構注釋信息，使用ChIPseeker（版本：1.18.0）軟件對其進行功能區域注釋，當DMR所在區域與特定基因功能元件有重疊時，將相應的基因挑選出來，稱為DMR相關基因。
差異甲基化區域圖：A. 差異DNA甲基化區域的基因組分布簡圖，差異甲基化區域的基因組分布簡圖更加簡潔的展示了差異DNA甲基化位點在各條染色體的分布狀態。B. 差異甲基化區域細節展示圖，差異甲基化區域所在染色體和染色體上的物理位置。C、火山圖，火山圖用于展示組間差異區域的Δβ和顯著程度，圖中橫坐標為Δβ值，縱坐標為P值或adj.P值的負對數。圖中右上區域和左上區域分別代表hypermethylated和hypomethylated的區域，且具有統計學差異的區域。D. 熱圖，熱圖用于查看組間樣本的差異情況和組內樣本相似程度。
五、甲基化與基因組或轉錄組共同分析
生命現象的背后有著復雜的遺傳基礎與精密的調控分子機制，基因組的DNA序列構建了遺傳基礎；甲基化修飾、組蛋白修飾和lncRNA的轉錄前調控，非編碼RNA（包括miRNA, lncRNA與circRNA）的轉錄后調控，以及翻譯后的蛋白修飾等組成了復雜而精密的調控過程；mRNA、蛋白的表達高低或修飾情況以及代謝物的豐度是以上過程為適應環境而共同作用的目的和結果。僅靠單一組學的分析只能在單個層面中得到信息，并不能從整體上理解疾病與生命過程發生的來龍去脈。在后基因組時代，科學研究會朝著更全面、更精細的方向發展，多組學研究以至系統生物學研究將是一個大趨勢。
我們為多組學研究提供了整體解決方案，其中也包括數據分析的思路與結果展示的方法。多組學的分析可通過基因組-轉錄組、基因組-甲基化-轉錄組、甲基化-轉錄組等不同形勢。
甲基化多組學高級分析：A. 甲基化與表達譜相關性熱圖，此類型的圖也可展示其他不同組學的相關性。B. 基因組、轉錄組與甲基化組變異通路圖，可在同一張圖上展示通路中的基因組、轉錄組與甲基化組等不同組學上的變異，以及多組學的變異對通路的影響。C. 關鍵基因的多組學相關性圖，以相關性圖的形式，同時展示關鍵基因在基因組、轉錄組與甲基化等多組學層面上的相關性，共變異或甲基化狀態。
