近年來(lái)，單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)在生物醫(yī)療科研領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，解決了傳統(tǒng)RNAseq中細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題，在單個(gè)細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)組織或器官基因表達(dá)的分析，構(gòu)建了完整的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜。為精細(xì)細(xì)胞亞群分群、鑒定和特征Marker基因篩選、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控通路發(fā)現(xiàn)，以及細(xì)胞發(fā)育軌跡、胞間通訊提供了解決方案。目前單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類(lèi)、模式動(dòng)物等的研究中。
雖然單細(xì)胞技術(shù)在植物中也有一定的應(yīng)用，但是仍然存在不少挑戰(zhàn)：
2植物細(xì)胞生存于剛性的細(xì)胞壁中，在制備單細(xì)胞懸液過(guò)程中要先從細(xì)胞壁中釋放出細(xì)胞來(lái)。使用酶解液破壞細(xì)胞壁對(duì)植物來(lái)說(shuō)是一種是生存脅迫，如果操作不當(dāng)會(huì)引起細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)激情況下的轉(zhuǎn)錄，會(huì)引起轉(zhuǎn)錄偏差。
2原生質(zhì)體制備過(guò)程中會(huì)引起滲透壓改變，進(jìn)而原生質(zhì)體大小也會(huì)發(fā)生改變。
2制備原生質(zhì)體酶解配方個(gè)性化較高，不同組織之間差別比較大，并且酶解出來(lái)的原生質(zhì)體很脆弱，活性波動(dòng)較大。
2植物單細(xì)胞測(cè)序后生信分析也是不小的挑戰(zhàn)，由于植物基因組研究本身存在局限性，加上植物較為重要的線粒體和葉綠體基因組研究較難，基因注釋存在一定難度。
針對(duì)以上難點(diǎn)，中科普瑞單細(xì)胞平臺(tái)在植物原生質(zhì)體制備、生信分析等方面進(jìn)行技術(shù)研發(fā)，并利用BD單細(xì)胞研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，使用客戶(hù)已發(fā)表的技術(shù)資源，開(kāi)發(fā)了【中科普瑞植物單細(xì)胞測(cè)序解決方案】，具體包括植物原生質(zhì)體制備+單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及生信分析系統(tǒng)解決方案、植物細(xì)胞核提取+單細(xì)胞核文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序解決方案。
一、植物原生質(zhì)體制備+單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序+生信分析
服務(wù)方案：植物原生質(zhì)體制備+單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序+生信解決方案（使用NCBI/JGF/Ensembl等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋轉(zhuǎn)錄組，獲得Marker基因）
已成功制備原生質(zhì)體的植物類(lèi)型：擬南芥、玉米、大豆、水稻、小麥、煙草、楊樹(shù)、荷葉、茶、火龍果、甘薯、薄荷、番茄等。
圖 使用NCBI對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了基因注釋和Marker gene提取
二、植物細(xì)胞核提取+單細(xì)胞核文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序
本方案主要利用了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王惠聰教授課題組近期在國(guó)際期刊《Cells》發(fā)表的單細(xì)胞核文庫(kù)構(gòu)建方案Systematic Methods for Isolating High Purity Nuclei from Ten Important Plants for Omics Interrogation。
該篇文章的技術(shù)方案由王惠聰教授課題組與BD Total Solution團(tuán)隊(duì)共同合作，利用碧迪醫(yī)療流式細(xì)胞分選儀和Rhapsody單細(xì)胞測(cè)序建庫(kù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)優(yōu)化了10種重要植物種類(lèi)的細(xì)胞核提取方法并用于單細(xì)胞核文庫(kù)構(gòu)建，是世界上首次針對(duì)主要農(nóng)作物高純度單細(xì)胞核的文庫(kù)構(gòu)建整體解決方案。單細(xì)胞核測(cè)序能夠克服植物單細(xì)胞樣本制備過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，但是植物細(xì)胞組成復(fù)雜，成功分離細(xì)胞核難度極高。本技術(shù)方案優(yōu)化建立了針對(duì)不同材料的提取和純化方法，成功解決植物單細(xì)胞測(cè)序樣本單細(xì)胞核分離困難、純度低、得率少的關(guān)鍵問(wèn)題。通過(guò)碧迪醫(yī)療流式分選儀富集純化得到的高純度細(xì)胞核可以滿(mǎn)足單細(xì)胞核建庫(kù)測(cè)序及qPCR基因表達(dá)量檢測(cè)，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用BD Trucount能夠精確計(jì)算組織中的細(xì)胞核數(shù)量，為植物科研工作者提供了寶貴的方法參考依據(jù)。
包括的九種重要的農(nóng)作物/經(jīng)濟(jì)作物及模式植物的葉片
水稻、玉米、大豆、番茄、葡萄、香蕉、柑橘、蘋(píng)果、荔枝和擬南芥。
細(xì)胞核提取Buffer開(kāi)發(fā)優(yōu)化
不同種類(lèi)的植物結(jié)構(gòu)有較大的區(qū)別，從草本到木本植物，細(xì)胞核提取難度逐漸增大。針對(duì)不同類(lèi)型植物，Buffer成份有明顯差異，其中螯合劑，金屬離子以及表面活性劑的含量的選擇最關(guān)鍵。本方案根據(jù)每種植物特性開(kāi)發(fā)了8種提取Buffer，可以高效的分離得到細(xì)胞核粗提液，使用BD Rhapsody Scanner掃描，可以清晰的觀察到植物細(xì)胞核及組織碎片。
細(xì)胞核純化分選
細(xì)胞核粗提液中含有大量雜質(zhì)，未經(jīng)純化的細(xì)胞核溶液有強(qiáng)烈的自發(fā)熒光，且游離的含核酸細(xì)胞器（葉綠體和線粒體），以及未裂解完全的細(xì)胞碎片，會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)基因擴(kuò)增，單細(xì)胞建庫(kù)等實(shí)驗(yàn)。通過(guò)BD FACSMelody分選，可以區(qū)分顆粒大小及PI的信號(hào)強(qiáng)度，分選的到高純度的細(xì)胞核。
細(xì)胞核絕對(duì)計(jì)數(shù)方式
在發(fā)育及育性的研究中，細(xì)胞核計(jì)數(shù)是非常重要的測(cè)量指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)方案中使用BD Trucount計(jì)數(shù)管，可以對(duì)提取的細(xì)胞核精確計(jì)數(shù)，避免染色核漂洗帶來(lái)的隨機(jī)損失。比較了10種植物的細(xì)胞核絕對(duì)數(shù)量，并計(jì)算不同組組織與細(xì)胞核提取得率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞核計(jì)數(shù)方式穩(wěn)定可靠，不同植物的細(xì)胞核得率與其干重有顯著的相關(guān)性。
單細(xì)胞核測(cè)序及細(xì)胞核應(yīng)用場(chǎng)景
提取的高純度植物細(xì)胞核可直接用于BD Rhapsody建庫(kù)，由于細(xì)胞核純度高質(zhì)量好，單細(xì)胞降維結(jié)果分群明顯，通過(guò)marker基因拆分，可以清晰的看到不同的細(xì)胞群分布。此外，高質(zhì)量的細(xì)胞核可以用于基因擴(kuò)增和基因表達(dá)量檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)方案。
