標題：Expansion of macrophage and liver sinusoidal endothelial cell subpopulations during non-alcoholic steatohepatitis progression
發表期刊：ISCIENCE（IF=6.107）
合作單位：上海市第一人民醫院
研究背景與研究目的：肝非實質細胞（NPCs）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的進展中起著關鍵作用。作者通過單細胞測序探索NPC的異質性，并確定導致NASH進展的NASH特異性亞群。
檢測手段：BD scRNA_seq RNAseq 免疫熒光
實驗對象：3高脂高糖飲食（HFD）小鼠肝臟 VS 3自由飲食取水（Chow）小鼠肝臟。
研究結論
1、健康和NASH小鼠轉錄異質性分析
建立高脂高果糖飲食(簡稱 HFD 組)小鼠模型。20 周后，HFD組的體重、肝臟重量和肝臟體積較喂食食物的組(簡稱食物組)顯著增加(圖1A)。HFD小鼠出現脂肪變性、肝細胞氣球樣變、小葉炎性浸潤和肝纖維化，與 NASH的病理表現一致(圖 1B)。從HFD (n = 3)和 Chow (n = 3)小鼠中分離肝NPC，并進行 RNA-Seq 分析。在HFD，HFD 和 Chow 之間共發現 1，613 個差異表達基因，其中 830 個基因上調，783個基因下調，包括代表 NAMs (Trem2， Gpnmb)、 HSCs(Dcn，Colla 1)、ECs (Lyve1)、DC(FLT3)和NK細胞(Xc11)的基因(圖1C)。這些結果表明，在NASH進展過程中，各種類型的NPC 可能受到影響。
圖1 健康和NASH小鼠轉錄異質性分析
為了研究不同類型的NPC及其亞群在 NASH發病機制中的確切作用，還對同一批接受RNA-Seq 處理的NPC 進行了 scRNA_seq 分析。從6只小鼠的肝臟中分離出48，272個細胞，成功測序，其中29，784個細胞來自HFD小鼠，18，488個細胞來自 Chow小鼠。根據細胞類型特異性標記基因，可將這些細胞分為 10 種不同的類型，包括ECs、T細胞、B細胞、NK 細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞、造血干細胞及其他主要由肝細胞和紅細胞組成的細胞(圖 1DF)。B細胞和ECs是HFD和Chow小鼠中最豐富的細胞類型，分別占NPCs 的28.0 33.6%和25.3 29.5%(圖1G和S1B)。HSC的平均比例從 Chow 組的0.2%顯著升高到HFD組的0.5%，NK細胞的平均比例從5.0%降低到3.5%(圖1H)。作者還發現，HFD小鼠的ECs 和巨噬細胞比例高于 Chow 小鼠。此外，HFD 組的樹突狀細胞明顯多于 Chow 組。這些發現進一步表明，NPC，尤其是HSC、DC、ECs、NK細胞和巨噬細胞的改變可能與 NASH的發生有關。
2、NASH肝臟巨噬細胞異質性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞擴增研究
scRNA_seq 數據顯示，肝巨噬細胞由六個簇組成(簇7、12、19、21、23、25)。在這里作者使用小提琴圖展示各個聚類中的的markergene（圖2A），分析發現聚類21中的大多數細胞來自HFD，與Chow小鼠相比，在 HFD小鼠中觀察到該亞群的顯著擴增(圖2B-C和s 2B)。聚類21，23是Itgad和Fcr15高表達，但不含Trem2和Gpnmb等NAMs 標記基因(圖2A)。值得注意的是，幾乎所有這些Itgadhi/Fcr15hi細胞均來自HFD小鼠，這表明它們可能是與NASH進展密切相關的獨特巨噬細胞亞群(圖2B-C)。
通過qPCR分析，在肝NPC 中驗證了HFD小鼠中Trem2、Gpnmb、Itgad和Fcr15的上調，這進一步表明，在NASH進展期間，聚類21和23的亞群擴大(圖2D)。擬時序分析顯示，以Top2a和Mki67 高表達為特征的分裂細胞位于軌跡路徑的起點。巨噬細胞通過以Itgadhi/Fcr15hi和Trem2hi/Gpnmbhi細胞為特征的中間狀態，達到Timd4hi/Clec4fhi細胞狀態(圖2E-G)。
接下來，作者進行了免疫熒光和流式細胞術分析，以確認肝臟中存在Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞。與 scRNA_seq 的結果一致，作者發現在 NASH肝臟中，Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞亞群顯著擴增（2H）。此外，在F4/80+ CD11b+雙陽性巨噬細胞中，HFD組的Fcr15+細胞比例明顯高于Chow組(圖2I)。作者的結果表明，除NAMs 外，小鼠肝臟中還出現了Itgadhi/Fcr15hi巨噬細胞亞群，兩者在NASH進展期間均擴增。
圖2 NASH肝臟巨噬細胞異質性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞擴增研究
3、NASH肝臟ECs細胞異質性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs細胞擴增研究
為了進一步探索 NASH小鼠中 ECs 的異質性，作者將ECs重新聚類為 13 個亞群((圖3A)。表現出D114/Msr高表達但Wnt2/Kit 低表達的ECs-1和ECs-8 被認為是門靜脈周圍ECs，而表現為Wnt2/Kit中高表達但D114/Msr1極低表達的ECs-0、ECs2、ECs-4和ECs- 10 可能屬于中樞周圍 ECs。與門靜脈周圍和中樞周圍ECs 相比，ECs-3、ECs-5 和ECs-7的 D14/Msr1 和 Wnt2/Kit 表達中等，但Cxc110 表達獨特，被視為 LSECs。如圖3D 所示，HFD組LSECs 亞群ECs-3、ECs-7 比例升高，門靜脈周圍亞群 ECs-1、中樞周圍亞群 ECs-2 比例顯著降低。ECs-3 大量表達Egr1(可促進膽汁淤積性肝損傷小鼠的炎癥)，以及與細胞增殖密切相關的Plk2。ECs-7 以Isg15、Ifit1、Ifit2、Ifit3、Ifi44、Ifi47 等干擾素誘導基因高表達為特征，且Ly6a 也高表達。作者通過免疫熒光證實了HFD小鼠肝臟中Egrlhi 亞群和Ly6ahi亞群的擴增(圖3E-G)。流式細胞術分析顯示，Ly6a+ ECs約占HFD小鼠NPC的10%，而在 Chow 小鼠中僅占 5%左右(圖3I)。這些結果表明，在NASH進展過程中，Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs亞群擴增。
圖3 NASH肝臟ECs細胞異質性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs細胞擴增研究
4、在NASH發展早期Egrlhi LSECs、Ly6ahiLSECs與Itgadhi/Fcr15hi巨噬細胞的擴增研究
HE染色，流式分析發現隨著隨著高脂肪高果糖飲食 8 周、16 周、32 周的延長，肝臟脂質蓄積、炎性浸潤、纖維化逐漸加重，這兩種改變在第 32 周時都顯著增強。并且Itgadhi/Fcr15hi巨噬細胞與Egrlhi 、Ly6ahi LSECs數量與逐漸增加，相關基因分析也是如此。這些結果表明，Itgadhi/Fcr15hi巨噬細胞亞群、Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs出現在NASH早期，并在病理進程中發生急劇擴張，提示它們可能參與了NASH的加重。
圖4在NASH發展早期中Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs與Itgadhi/Fcr15hi巨噬細胞的擴增研究
5、NASH肝臟中增強的NPC細胞通訊研究
作者發現，與 Chow 組相比，HFD 組的大部分細胞間通訊都得到極大的增強(圖6A-B)。在HFD小鼠中，HSC與多種細胞類型積極溝通，在HSC和ECs之間觀察到最強的相互作用。此外，在 HFD，檢測到 HSC 與巨噬細胞(包括KCs、MDM和分裂細胞)之間存在較強的相互作用，同時HSC自身內部的細胞間通訊也顯薯增強，Itgad、Fcr15、Egr1、Plk2、Ly6a、Ifitl、Ifit3 和Isg15與Colla1的ISG 15呈正相關(圖6C-E)，表明在NASH進展過程中，HSC與Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞亞群與Egrlhi LSECs 、Ly6ahi LSECs之間可能存在密切的相互作用。總之，作者的結果表明，NASH肝中NPC之間的細胞間相互作用，尤其是HSC與ECs/巨噬細胞之間的相互作用增強。
圖5NASH肝臟中增強NPC細胞通訊研究
總結
作者的研究發現表明，在肝NPC 中，亞群的Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞亞群與Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs 在 NASH 早期積聚，其擴展與疾病嚴重程度密切相關，提示這些亞群可能參與了 NASH的進展。NASH 肝中NPC之間的細胞間相互作用增強，HSC與Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞亞群與Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs之間發生密切相互作用，表明這些亞群可能有助于HSC的活化。作者的研究對 NASH進展中NPC的異質性提供了見解。在后續研究中，需要研究健康和患病肝臟中Itgadhi/Fcr15hi 巨噬細胞亞群與Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs的功能和意義。
