文章名稱：Single-cell RNA sequencing reveals a unique pericyte type associated with capillary dysfunction
發表期刊：Theranostics（IF：11.6）
合作單位：南京中醫藥大學
研究背景：毛細血管功能障礙與一系列以周細胞和內皮細胞（EC）細胞變性為特征的危及生命的血管疾病有關。然而，控制周細胞異質性的分子機制尚未完全闡明。
研究目的：視網膜毛細血管功能障礙下異質性周細胞分子機制研究
實驗對象：在氧誘導增殖性視網膜病變（OIR）模型與室內空氣(RA)對照小鼠進行單細胞RNA測序
主要檢測手段：BD Rhapsody scRNA-seq
主要結果展示
01、單細胞測序發現視網膜病理性血管生成過程中異質性周細胞亞群特征
研究者構建了OIR小鼠模型，采集OIR小鼠(P12T和P17T)以及RA對照小鼠P12和P17 (P12C和P17C)的視網膜，進行單細胞RNA測序鑒定了10種不同的細胞類型。使用標記基因對周細胞進行了進一步的分群鑒定，確定了3個轉錄上不同的周細胞亞群。在亞群2中，Rgs5、Acta2、Mgp和Rgs4被顯示為細胞遷移率、細胞增殖和細胞分化的關鍵調節因子，表明周細胞亞群2易于被激活并可能參與病理性血管生成。
02、異質性周細胞亞群特征基因功能分析
對周細胞亞群2中的前200個高表達基因進行KEGG富集和GO富集分析發現，局灶性粘連、細胞外基質組織、PI3K-Akt-mTOR信號通路、ECM-受體相互作用和膠原形成途徑中高度富集。細胞粘附、細胞遷移和細胞外基質組織，可能發生在質膜或細胞外基質中。
上述證據表明，周細胞亞群2與病理性血管生成過程密切相關。為了研究周細胞亞群2的轉錄組異質性，對亞群2與其他周細胞亞群(0和1)之間的周細胞表達譜和關鍵標記基因進行了比較。KEGG分析顯示，周細胞亞群2中的這些差異表達基因在局灶性粘附、信號轉導、細胞外基質組織和ECM-受體相互作用方面高度富集。GO富集分析進一步揭示，亞群2與其他周細胞亞群之間的差異表達基因在很大程度上與細胞外基質重塑相關，如細胞粘附和ECM組織化，可能發生在膜或細胞外基質處。
03、Col1a1表達模式及其調節周細胞分子功能驗證
? Col1a1表達模式
qRT-PCRs和western blots顯示，與RA對照組相比，P17時OIR小鼠視網膜中Col1a1表達顯著增加。在視網膜平板支架中，免疫熒光分析顯示Col1a1與視網膜血管標記物isolatin B4(IB4)共定位。此外，其在血管生成區域的表達顯著增加。在視網膜冷凍切片中，免疫熒光分析顯示Col1a1與周細胞標志物PDGFRβ(血小板衍生生長因子受體β)共定位，提示Col1a1在周細胞中表達。綜上所述，上述證據表明Col1a1主要在周細胞中表達，并可能參與血管生成。
? Col1a1是體外周細胞生物學的關鍵調節因子
針對Col1a1沉默設計了三種不同的Col1a1 siRNAs。轉染Col1a1 siRNA導致周細胞中Col1a1表達水平降低。值得注意的是，Col1a1 siRNA3對Col1a1表達的抑制作用最大。Matrigel共培養試驗顯示，周細胞中Col1a1沉默顯著減少了人周細胞向HRVECs募集的數量。將周細胞暴露于氯化鈷以模擬低氧應激。鈣黃綠素‐AM/PI染色分析顯示，與CoCl2處理組相比，Col1a1沉默可加重CoCl2誘導的周細胞凋亡，PI陽性細胞增多即是證明。進一步進行羅丹明123染色和JC-1染色，檢測周細胞線粒體去極化的變化。對于CoCl2處理組，Col1a1沉默進一步加重了CoCl2誘導的周細胞線粒體去極化。以上表明：Col1a1是體外周細胞生物學的關鍵調節因子。
? Col1a1在體內調節視網膜周細胞功能和血管完整性
設計了三種靶向Col1a1的短發夾RNA(shrna)，并將其插入病毒載體中以獲得Col1a1 shRNAs。通過qRT-PCR分析評估了沉默效率。結果表明，Col1a1 shRNA1對視網膜中Col1a1表達的沉默效率最高。
選擇Col1a1 shRNA1進行后續免疫熒光染色以確定Col1a1沉默對視網膜血管中周細胞覆蓋的影響。與Ctrl組比較，OIR組、OIR+Scr shRNA組視網膜血管周細胞/EC比值無變化。注射Col1a1 shRNA1導致視網膜血管中的周細胞/EC比值降低，這表明Col1a1沉默導致視網膜血管中的周細胞覆蓋率顯著降低。
? Col1a1調節周細胞-肌成纖維細胞轉化和內皮-間充質轉化
在周細胞中，Col1a1沉默可抑制結蛋白和NG2的表達，增強纖連蛋白和a-SMA的表達。周細胞與內皮細胞間的串擾也參與病理性血管生成過程。細胞共培養試驗顯示，周細胞中Col1a1沉默延緩了內皮-間充質轉化(子宮內膜)的進程。周細胞中Col1a1沉默可以逆轉TGF-β1誘導的內皮細胞外基質標志物(纖連蛋白和α-SMA)的上調以及TGF-β1誘導的內皮標志物(CD31和VE-鈣粘蛋白)的減少，表明周細胞中Col1a1沉默對EC生物學有間接影響。
采用激光誘導CNV模型和OIR模型研究Col1a1沉默對α-SMA表達的影響。與CNV組或OIR組比較，Col1a1沉默不影響IB4表達水平，但導致α-SMA表達明顯減少，提示Col1a1沉默延緩毛細血管基質重塑，最終可能延緩病理性血管生成的進程。
04、Col1a1調節異常在視網膜血管疾病中的臨床意義
進一步研究了Col1a1調節異常是否發生在視網膜血管疾病中。在PDR（增殖性糖尿病視網膜病變）患者視網膜樣本和房水（AH）樣本中，ELISA檢測到的Col1a1水平較高。據此推測，在ROP（早產兒視網膜病變）患者的臨床樣本中，Col1a1也存在調節失調。ELISA檢測顯示，在ROP患者的AH樣本中，Col1a1表達水平顯著上調。總之，這些結果表明Col1a1調節異常參與視網膜血管疾病的發病機制。
綜上，通過構建小鼠視網膜單細胞轉錄組的圖譜，將視網膜周細胞分為3個不同的亞群。經鑒定，周細胞亞群2易患視網膜毛細血管功能障礙。基于單細胞測序結果，Col1a1被鑒定為周細胞亞群2的標記基因和毛細血管功能障礙的有前景的治療靶點。Col1a1在周細胞中大量表達，在OIR視網膜中表達明顯上調。Col1a1沉默可延緩周細胞向內皮細胞的募集，加重低氧誘導的體外周細胞凋亡。Col1a1沉默可縮小OIR視網膜新生血管區和無血管區，抑制周細胞-肌成纖維細胞轉化和內皮-間充質轉化。此外，Col1a1在增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)或早產兒視網膜病變(ROP)患者的房水中表達上調。
這些發現提高了對視網膜細胞復雜性和異質性的認識，對未來毛細血管功能障礙的治療具有重要意義。
