遺傳密碼除了ATCG四堿基之外，其中胞嘧啶C也因其嘧啶環第5位碳原子的甲基化修飾，攜帶表觀遺傳信息而被稱為第5位堿基（5-甲基胞嘧啶，5mC）。DNA的甲基化修飾自1948年被發現以來，一直都是表觀遺傳領域的研究熱點[1]。DNA的甲基化修飾賦予了DNA雙鏈除蛋白質編碼信息外的表觀遺傳記憶，對基因組穩定性、基因表達和發育具有深遠的影響[2]。隨著DNA的去甲基化酶--DNA雙加氧酶TET的發現，胞嘧啶甲基化修飾的氧化形式才漸漸進行人們的視野[3, 4]。5羥甲基化胞嘧啶是甲基化胞嘧啶最常見的氧化形式，不單單是5mC主動去甲基化的中間體，而且是基因組中穩定存在的修飾形式，有著特異的結合蛋白，在調控胚胎發育、干細胞分化、神經系統的塑造及在腫瘤等復雜疾病中具有重要作用[2, 5]。
// 5hmC的分析技術
用以區分胞嘧啶與5mC及其氧化產物的方法很多，大體上可以分為基于物理（HPLC、質譜等），化學（亞硫酸氫鹽、高釕酸鉀等）以及生物（限制性內切酶、TET酶、APOBEC酶、5hmC抗體、MBD蛋白等）三種原理。然而胞嘧啶的不同修飾形式在分子結構上具備相似性，所以我們常用的化學或生物的方法并不能很好的區分5mC及其氧化衍生物。例如常用的亞硫酸氫鈉（BS）法就不能區分5mC與5hmC，平常BS方法得到的所謂5mC其實是5mC與5hmC的集合。
圖 1. 胞嘧啶及其不同修飾衍生物的分子結構。
胞嘧啶修飾的分析技術是從5mC開始的，自5hmC于2009年被發現后多種技術被開發以檢測5hmC水平，這些技術主要是基于親合層析的原理，并不能在單堿基水平分析5hmC的修飾情況(圖 2)。隨后于2012年在Cell與Nature發表的兩篇文章中分別報道了TAB-seq與oxBS-seq技術，達到了單堿基分辨基因組中的5hmC的水平，這兩種技術的關鍵是5hmC的氧化，分別采用TET酶或高釕酸鉀氧化原理[6, 7]。其后隨著5fC的發現也開發了5fC的檢測技術(圖 2)。
圖 2. a, 胞嘧啶修飾的技術技術發展史。b, TAB-seq原理示意圖。c, oxBS-seq原理示意圖。
對于5mC以及其氧化產物的區分技術手段多樣，而且受到各種修飾形式的化學結構的特點的影響，目前已經開發了的甲基化修飾研究技術種類繁多，讓剛剛接觸的研究人員難以抉擇。以下有幾張經典的總結示意圖幫助大家理解。
如圖 3所示，對于5mC及其氧化形式的檢測最常用的方法有兩種：基于BS的化學修飾法，以及基于親和層析的富集法，各自的代表性技術以及能夠檢測的堿基修飾各不相同，所以例如oxBS-seq方法要分析5hmC，需要用BS-seq方法得到的結果減掉oxBS-seq的結果。
圖 3. 5mC及其氧化物的分析原理示意圖。（基于BS的化學修飾法與基于親和層析富集法）
多年來，眾多科學家們前赴后繼開發了多種DNA 修飾的檢測和定量技術，這些技術將化學修飾方法或酶促反應靈活地與芯片或測序相結合，使得我們能夠更經濟快捷地研究表觀遺傳變異與表型之間的關聯。對甲基化修飾分析技術感興趣的話，可以參考圖 4，其中更全面地總結了不同技術手段相組合而得到的各種胞嘧啶修飾分析技術。
圖 4. DNA甲基化修飾分析技術原理匯總。
// 中科普瑞推出『高通量5hmC甲基化標志物篩選新技術』
對于5hmC的研究要考慮到成本、分析時間與準確度等關鍵因素。雖然測序技術能夠提供很多序列特征的信息，但當測序深度較低時則難以得到準確的甲基化定量結果。而甲基化芯片是成熟的甲基化研究工具，因其穩定而準確的結果，被廣泛應用于腫瘤、老年性疾病等復雜疾病的研究中。特別是對數據結果的可靠性有著嚴格要求的表觀基因組關聯研究，Illumina的850K芯片是首選平臺。然而850K芯片依賴于傳統亞硫酸氫鹽（BS）方案，不能區分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。中科普瑞此次推出了基于Illumina850K甲基化芯片檢測的高通量5hmC檢測新方法，以特異性穩定可靠檢測全基因組中85萬個胞嘧啶的5hmC修飾。技術原理如圖5所示。
圖 5. 利用Illumina甲基化芯片進行5hmC檢測技術路線。
該技術基于甲基化芯片可靠的技術平臺，能夠穩定可靠地在全基因組水平上檢測5hmC修飾情況。如圖6，圖7所示借助該技術，可以對基因組中的5hmC修飾進行檢測，可達到較高的重復性。
圖 6. 技術質控結果。a, 基于亞硫酸鹽轉化的技術重復散點圖。b. 對5hmC進行芯片檢測新方法的技術重復散點圖。
圖 7.染色體區段展示5hmC技術重復結果。
我們同時利用該技術檢測了一對腫瘤樣本，并與其BS檢測結果進行對比，驗證在腫瘤中普遍地低5hmC現象。
圖 8. 腫瘤中的5hmC差異染色體分布圖，在腫瘤中的5hmC整體低于癌旁。
從染色體分布結果可見5hmC在基因的啟動子區以及CpG島結構的低甲基化修飾水平。
圖 9. 同一對腫瘤與癌旁樣本中的BS結果以及5hmC結果染色體展示。由上往下依次為Ca_BS, N_BS, Ca_5hmC, N_5hmC, CpG島注釋與轉錄本注釋。
中科普瑞此次推出高通量5hmC檢測新方法，擁有高效、簡便、準確的技術特色，再結合成熟而穩定的IIumina 850K甲基化芯片平臺，將完美解決5hmC標志物篩選的技術痛點，實現5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的并行高通量檢測。歡迎廣大科研工作者來電或在線咨詢5hmc檢測合作服務事宜！
